Percobaan 4
Kromatografi Kolom dan
Lapis Tipis
A. Tujuan
Mahasiswa
dapat memahami:
1.
Teknik-teknik
dasar kromatografi kolom dan lapis tipis.
2.
Prinsip
dasar dari kromatografi.
3.
Pengalaman
mengisolasi langsung campuran senyawa sampai pemurniannya secara kromatografi
kolom.
B. Prinsip Dasar
Kromatografi adalah salah satu teknik
untuk menganalisis secara kualitatif, yang berarti kromatografi dapat digunakan
dalam usaha mengidentifikasi suatu sampel. Namun ada juga kromatografi yang
dapat menganalisa kadar masing-masing komponen dari suatu sampel (kuantitatif)
seperti kromatografi cair-gas. Prinsip kromatografi secara umum adalah pemanfaatan
beda waktu tiap komponen yang dikandung sampel sewaktu berada pada fasa
stasioner. Perbedaan waktu ini khas untuk tiap jenis senyawa karena adanya
perbedaan kofisien distribusi tiap komponen di dalam fasa bergerak dan fasa
stasioner yang tentu saja berhubungan dengan kepolaran dari komponen tersebut.
Pada percobaan ini, jenis kromatografi yang digunakan adalah kromatografi kolom
yang menggunakan fasa cair sebagai fasa gerak dan fasa padat sebagai fasa diam.
C.
Data dan Pembahasan
Pemisahan komponen senyawa analgesic
dalam obat pain-killer
Obat yang dipilih adalah obat
penghilang rasa sakit adalah Aspirin produksi Bayer. Pertama, setengah dari
tablet dihancurkan dengan mortar agar dapat larut pada pelarut etil asetat.
Etil asetat dipilih sebagai pelarut karena sifatnya relatif non polar (eter), sehingga
walau dapat melarutkan analgesic aspirin, etil asetat tidak mendominasi absorbansi
fasa diam. Aspirin sendiri bersifat polar dan dapat membentuk ikatan hidrogen
dengan silika gel karena memiliki gugus –OH. Gugus ini dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan silika gel. Setelah binder mengendap, larutan dipipet tanpa
menyertakan binder.
Silika gel dibuat dengan menambahkan
larutan etil asetat-n heksana dengan perbandingan 10:1 pada bubuk silika gel.
Setelah ditambahkan larutan etil asetat-n heksana dan diaduk, silika gel yang
berbentuk bubuk mengembang menjadi bubur. Setelah itu bubur dimasukkan ke dalam
kolom makro. Bubur silika gel ini tidak boleh kering, karena jika sudah
mengering proses pemisahan dalam kolom tidak akan berlangsung. Hal ini dapat
dicegah dengan penambahan pelarut secara terus menerus. Hasil yang diperoleh
ditampung dan diteteskan pada pelat untuk diidentifikasi dengan kromatografi
lapis tipis.
Hasil yang didapat ditampung dalam
beberapa tabung, dengan eluat pada beberapa tabung awal berwarna bening. Selanjutnya
didapatkan eluat berwarna kuning dan selanjutnya kembali berwarna bening.
Tablet aspirin memiliki dua komponen
yang signifikan, yaitu acetylsalicylic dan kafein. Kafein adalah senyawa
alkaloid yang bersifat polar. Gugus N pada alkaloid juga dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan silika gel. Karena ikatan antara atom N-H (kafein) lebih kuat
daripada ikatan antara atom O-H, maka kafein berada pada fasa diam dalam waktu
yang lebih lama daripada acetylsalicylic. Fakta ini membuat acetylsalicylic
keluar terlebih dahulu, baru kafein. Kafein diduga merupakan eluat yang
berwarna kekuningan (larutan kafein berwarna kuning). Hal ini baru dapat
dipastikan dengan kromatografi lapis tipis.
Hasil kromatografi kemudian diteteskan
(berbentuk noda) pada pelat tipis. Diteteskan pula standar kafein dan aspirin
sebagai perbandingan. Karena lampu uv tidak tersedia, maka digunakan Iodin agar
noda dari tetesan aspirin dan kafein dapat menyerap iodin sehingga berwarna
kecoklatan. Hal ini disebabkan pelat di mana terdapat materi organik dapat
mengabsorbsi uap iodin. Namun pada pelat tidak terlihat noda kecoklatan pada
iodin dan kafein sampel, sedangkan pada noda standar terlihat noda kecoklatan.
Kegagalan pada kromatografi pelat
tipis disebabkan oleh terlalu panjangnya fasa diam (silika gel) pada kolom. Hal
ini menyebabkan setelah pemisahan berlangsung, hasil kromatografi yang didapat
kurang pekat. Hal ini dapat menyebabkan warna yang dihasilkan dari penyerapan
iodin tidak signifikan untuk dapat terlihat oleh mata.
Isolasi Pigmen dari Sampel Daun
Penyiapan sampel dilakukan dengan
menyaring jus bayam. Jus disaring untuk menghilangkan residu daun. Setelah itu
filtrat disentrifuga setelah sebelumnya ditambah pelarut berupa metanol,
heksana, dan aqua-dm. Sentrifuga yang dilakukan bermaksud untuk memisahkan
larutan. Larutan yang berwarna hijau bening kemudian dipindahkan dan dipanaskan
dengan penangas air. Pemanasan dengan penangas air ini bermaksud untuk
memekatkan larutan. Digunakan penangas air agar larutan organik tidak terbakar.
Kolom kromatografi skala mikro
menggunakan pipet yang ujungnya telah disumbat oleh kapas. Sebelumnya dilakukan
pra elusi dengan heksana agar adsorben mengembang dan siap mengabsorbsi pelarut
dan sampel yang akan dipisahkan. Warna yang berbeda kemudian ditampung, dengan
tabung reaksi.
Tabung
|
Warna
|
I
|
Putih kekuningan
|
II
|
Hijau kekuningan
|
III
|
Keruh
|
Hasil yang berwarna hijau diduga
mengandung pigmen dari daun bayam (klorofil). Tabung III setelah ditunggu
mengalami pemisahan.
Setelah hasil kromatografi kolom
didapat, dilakukan kromatografi lapis tipis dengan pengembang campuran n-heksan
: kloroform : metanol = 7 : 3 : 1. Setelah itu plat diberi noda dari
masing-masing tabung tetapi kembali tidak ada hasil yang didapat walau sudah
diberi iodin. Hal ini dapat disebabkan oleh kurang pekatnya jus bayam, sehingga
larutan pigmen yang didapat terlalu encer. Hal ini dapat menyebabkan penyerapan
iodin kembli tidak signifikan untuk dapat terlihat oleh mata.
Pemisahan Zat Pewarna Makanan
Percobaan ini merupakan percobaan yang
dilakukan oleh meja kami. Zat pewarna makanan yang didapat kelompok kami berupa
bubuk yang ditimbang seberat 0,5 gram, dan dilarutkan pada larutan 25%
etanol. Larutan bersifat pekat dan berwarna
ungu kemerah-merahan.
Setelah itu dilakukan persiapan kolom
berskala mikro. Sama dengan sebelumnya, dibuat dahulu silika gel sebagai fasa
diam dengan membuat buburnya terlebih dahulu. Setelah itu bubur dimasukkan ke
dalam pipet yang plop karetnya telah dilepas.
Run pertama yang kami lakukan gagal
karena fasa diam yang digunakan terlalu pendek. Kami lalu mengganti kolom
dengan pipet panjang. Panjang kolom pada run
kedua + 20 cm. Sebelum larutan
zat pewarna dimasukkan terlebih dahulu dilakukan pra elusi dengan menggunakan
heksan.
Laju pelarut dipercepat dengan plop
karet, dan terus menerus ditambahkan etanol 25% agar silika gel tidak mengering.
Hasil yang didapat berupa tiga tabung reaksi dengan 2 warna, merah bening dan
merah pekat. Setelah didapat hasil tersebut eluat berhenti mengalir. Keadaan
ini tidak berubah walau sudah ditunggu dalam waktu yang lama dan coba
dipercepat dengan plop karet berkali-kali. Hal ini diperkirakan disebabkan oleh
larutan zat pewarna terlalu pekat, dan bukan karena silika gel menering.
Pelarut terus ditambahkan sehingga silika gel tidak mungkin mengering.
Setelah diteteskan pada pelat tipis,
didapat hasil berikut:
Noda
|
Jarak yang Ditempuh
|
Rf
|
I
|
1,3
cm
|
0,394
|
II
|
1,45 cm
|
0,440
|
III
|
1,4
cm
|
0,424
|
Noda I :
Larutan zat pewarna yang belum dikromatografi
Noda II : Hasil kromatografi kolom yang terlebih dahulu keluar
Noda III : Hasil kromatografi kolom yang terakhir keluar
Jarak yang ditempuh sampel adalah 3,3
cm.
Rf hasil perhitungan menunjukkan bahwa
antara noda I dan noda II belum terdapat perbedaan yang signifikan. Hal ini
terjadi karena proses kromatografi belum selesai, sehingga pemisahan yang
berlangsung belum sempurna. Pemisahan ini dapat sempurna asalkan fasa diam
lebih panjang lagi. Solusi ini tidak efektif, karena fasa diam sudah cukup
panjang dan penambahan panjang dari fasa diam memakan waktu yang cukup banyak. Selain
itu penambahan panjang dari fasa diam akan menyebabkan kromatografi pada kolom
berlangsung lebih lama. Solusi yang lebih baik adalah dengan mengencerkan
sampel, karena kepekatan membuat komponen yang harus dipisahkan dalam larutan
semakin banyak. Saran saya adalah dalam modul ditetapkan berapa banyak pelarut
yang harus dipakai sewaktu melarutkan bubuk zat pewarna, karena dengan begitu
larutan yang didapat memiliki kadar yang lebih baik untuk kromatografi.
D.
Daftar Pustaka
Fessenden
& Fesenden.2003.Kimia Organik Jilid 1.
Jakarta:
Erlangga
Microsoft
Encarta Reference Library 2004 Keyword:
Chromatography
Perry ‘s
Chemical Engineers’ Handbook, Physical
and Chemical Data.
Wilcox,
Charles F. Jr and Mary F. Wilcox. 1995. Experimental
Organic Chemistry. USA:
Prentice Hall Inc. hal 122-134
http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/Biotech-Environ/CHROMO/be_types.htm
http://class.fst.ohio-state.edu/fst601/Lectures/Liqchr.htm
0 komentar:
Posting Komentar